Gen Haritalaması

Gen Haritalaması Gen Haritalaması: Ne Aramak, Haritalar Nasıl Oluşturuluyor, Neler İçeriyor, Nasıl Yorumlanıyor? Gen haritalaması, genlerin kromozomlar üzerinde bulunduğu yerlerin (lokus) gösterilmesidir Böylece insan genomunun anatomisi ortaya çıkarılır Pekçok genin ve öteki kalıtımsal markerICODElarin birbirlerine tarafından bir kromozom baştan başa diziliş sırasının haritalanmasıyla bir kromozomun haritasını ya da bütün genom haritasını dışında tutmak mümkündür Bu haritalama, insan vücudu fonksiyonlarının bilinmesi için gereklidir Bu Nedenle insan kalıtımsal hastalıklarının heterojenite ve segregasyon analizleri bu bilgiler ışığında yapılabilecek ve gen tedavisi gerçekleştirilebilecektir Sitogenetik haritalama, genetik haritalama ve somut haritalama elde etmek üzere temelde üç herif gen haritası vardır Sitogenetik haritalar, ilk olarak sitogenetik bantlama tekniklerinin oluşturulmasıyla farklı kromozomları tanımanın yanında, subkromozomal bölgelerin de ayırdedilmesiyle ortaya çıkmıştır Bu cins haritalar düşük rezolüsyonlu (yaklasık 6Mb) olmakla birlikte genlerin ve diğer DNA dizilerinin haritalanmasında fazla basit bir yöntem olan kromozom in situ hibridizasyonu için zemin hazırlamıştır Böylece uygun koşullarda yapılan hibridizasyondan sonra elde edilen sinyal probla, tanınan DNA dizisinin bir harita lokasyonunun tanımlanması sağlanabilir Günümüzde in situ hibridizasyon teknikleri floresan in situ hibridizasyon olarak geliştirilmiştir Yöntem, belirtilmiş bir DNA bölgesi kullanarak bütün kromozomlar içinde eşdeğer bölgeyi bulmak şeklinde uygulanır DNA bölgesi, radyoizotopla ya da floresanla işaretlendikten daha sonra ısıtma ve soğutma işlemlerini takiben tek iplik haline getirilir Boyanmamış ve lam üzerinde yayılmışgenharitalamasi5c5a4c447e05balt genharitalamasi5c5a4c447e05balt genharitalamasi5c5a4c447e05balt genharitalamasi5c5a4c447e05balt fazlara uygulanır Hazırlanan prob,genharitalamasi5c5a4c447e05balt genharitalamasi5c5a4c447e05balt genharitalamasi5c5a4c447e05balt genharitalamasi5c5a4c447e05balt fazda yer alan kromozomlardan kendi ile eşdeğer bölgesi ile birleşir (1) Floresan kullanılarak geliştirilen yeni yöntemler, çok kısa sürede klonlanmış DNA dizilerinin haritalamasında kullanılmaktadır Son yıllarda birden pozitif bambaşka renkli floresan işaretli problarla, kısa sürede daha pozitif alan incelenebilmektedir Keza fenotipin, gözlemlenebilir kromozomal baştan düzenlenmeleri veya kromozomal eksikliklerle ilişkilendirilmesiyle de sitogenetik haritalar oluşturulabilmiştir Bunun yanında translokasyonlar ve kromozomal delesyonlardan türemiş parçaları taşıyan somatik hücreli hibridleriyle doğal kromozom kırık noktaları veya radyasyon hibridleri kullanarak suni kırık noktaları haritalanabilir aynı zamanda düşük resolusyonlu fiziki haritalar olarak da adlandırılan bu sitogenetik haritalarda çözünürlük, genel olarak birkaç megabaz uzunluğundadır (2) Somatik hücreli hibrid çalışmaları ile de, kromozomlar ve onlar üzerindeki genlerin haritalaması çalışmaları yapılmıştır En sıklıkla fare ve insan elde etmek üzere iki öbür cins somatik hücreler, birleştirici bir casus veya özel inaktif viruslar aracılığı ile birleştirilir Bambaşka öbür fare insan hibrid gözenekli olan klonları elde edilir Başlangıçta bu klonlardaki hibrid hücrelerde hem insan hem fare kromozomları bulunurken, insan kromozomlarının bazıları her klonda bambaşka edinmek üzere selektif olarak kaybolur Özel bantlama yöntemleri ile morfolojik olarak, fare ve insan kromozomları kolayca ayırt edildiğinden hangi kromozom kaybı ile hangi özelliğin etkilendiği belirlenmeye çalışılmıştır Mesela bir enzim aktivitesi açısından fare somatik hücresinde eksiklik varsa, fakat hibrid hücrede bu eksiklik gözlenmiyorsa hangi insan kromozomu üstünde bu enzimin geninin bulunmakta olduğu belirlenmiştir Somatik hücreli hibridizasyon yöntemi ile birincil gen haritalaması, timidin kinaz enzim lokusunun 17 nolu kromozom üzerinde olduğunun gösterilmesi ile gerçekleştirilmiştir (3) Kalıtımsal haritalama, kısaca genomun matematiksel analizi olarak bilinir ve genlerin kromozomlar üzerindeki lokalizasyonlarının bulunmasında moleküler biyoloji ile ilgili yöntemler ve bir dizi karışık istatistiksel analizleri kullanır (4) Özellikle genetik etyolojili hastalıkların lokalizasyonlarının saptanması alanında son derece verimli bir usul olarak karşımıza çıkmaktadır Usul en genel anlamı ile lokalizasyonu aranan gen ile lokalizasyonu bilinen bir kalıtımsal belirleyicinin (“marker kuşaklar arasında birlikte kalıtılmasının test edilmesi esasına dayanır Bilindiği gibi kromozomlar mayozda aleyhinde karşıya gelerek parça değişimine uğrarlar (“crossingover Bu parça değişimleri sırasında birbirine yakın genler sıklıkla bir arada giderler Uzaktan yerleşimli genler ise bağımsız tertiplenme kuralına göre rastgele olarak bir arada gidebilirler ya da ayrılırlar Böylelikle yavru kuşaklarda ebeveynlerde olmayan yeni yapılanmalar ortaya çıkar Bu olaya “rekombinasyon olayı, ortaya çıkan ürünlere de “rekombinant ürünler denir (Şekil 1) Rekombinasyon kavramı genetik haritalama’nın kalbini oluşturur Temel hipoaaa “eğer aradığım gen kromozom lokalizasyonunu bildiğim marker’a fazla yakınsa mayozda birbirlerinden ayrılamayacak ve kuşaklar arasında defalarca marker allel ile birlikte kalıtılacaktır şeklinde özetlenebilir Diğer bir deyişle yavru kuşaklarda rekombinant bireylerin fazla sayıda bulunması aradığımız genden uzaklaştığımız anlamına gelecektir Bu yolla marker allel’in yeri bilindiğine tarafından (mesela 2p13 bandı) ilgilendiğimiz genin veya hastalığın yeri de bulunmuş olacaktır Rekombinasyon birimi centimorgan (cM) ile açıklama edilir 1cM her 100 kişide 1 rekombinant kişi olduğunun göstergesidir (1100 001) ve  (theta) işareti ile gösterilir Kalıtımsal uzaklıklar maddesel anlamda ölçülebilir uzaklıklar değildir Teorik olarak iki lokus aralarında 1cM’lık bir uzaklıktan söz edildiği süre, takriben 1 milyon baz çiftinden söz ediliyor demektir Ama bu defalarca belli değildir Sık rekombinasyon yapan bölgelerde (rekombinasyon hot spot’lari) 23 cM’lik bölgeler bedensel anlamda bazen beklendiğinden fazla daha kısa olabilirler Bu yöntem yolu ile bir gen haritalama çalışmasını edebilmek için kuşaklar arası kalıtımı izleyebileceğimiz ailelere gereklilik vardır Tekrar hipoaaaimizi meydana getirmek için genetik kalıbının belirlenmesi (tek gen, kompleks, mitokondrial vs) ve marker kavramından ne anladığımızın tamamen açıklanması gerekmektedir Kalıtımsal haritalama işlemi, ayrı moleküler biyolojik yöntemleri teknik olarak kullanmakla birlikte esas olarak istatistiksel bir analizdir ve tüm istatistik bilimi yöntemlerde olduğu gibi etkin bir kalıtımsal haritalama yapabilmek için hipoaaae yönelik parametrelerin çok sağlam olarak belirlenmesi gerekir Bu usul kullanılarak herhangi bir nitelik (gen, marker, hastalık gibi) haritalanmaktaysa da en geniş başvuru formu alanını, kalıtımsal hastalıkların haritalanması oluşturmaktadır Bu noktada genetik etkenlere bağlı olduğunu düşündüğümüz bir hastalığın gen haritalamasını yapmak istediğimizi varsayalım ve bu operasyon için zorunlu aşamalar, nedenleri ve gerekli parametreleri üzerinde tartışalım 1 Haritalanacak fenotipin özellikleri iyi tanımlanmalıdır: Fenotip: Bir varlığın genler ve çevre etkileşimleri sonucu türlü metodlar ile ortaya konulabilen özelliklerinin tümü olarak tanımlanabilir (5) Gen haritalamasının birincil aşaması haritalanacak genin, hastalığın, veya karakterin özelliklerinin standartlar oluşturarak saptanmasıdır Gen haritalama çalışmalarında genelde çok sayıda aileden toplanmış örneklere ihtiyaç vardır bu nedenle aniden fazla merkez misal toplama işlemine katılır Merkezler arasında fenotip karmaşası yaşandığı durumda gen haritalama çalışması yapmanın imkanı yoktur Tekrar psikiyatrik hastalıklar gibi hastalık spektrumunun muhakkak belirlenemediği şartlarda gen haritalama çalışmaları çoğunlukla başarısızlıkla sonuçlanır 2 Haritalamada kullanılacak metoda karar verilmeli ve kalıtım kalıbı olabildiğince kesin olarak belirlenmelidir Kalıtım kalıbının saptanmasının gen haritalama için seçilecek metodun belirlenmesi ile fazla yakın ilgisi vardır Gen haritalama metodları iki belli başlı gruba ayrılır a) Parametrik metodlar: Temel olarak Linkage (Bağlantı) analizleri olarak bilinir (Ülkemizde kullanılan terim linkaj analizidir ve metin içinde bu şekilde kullanılacaktır) Linkaj analizinin başarılı olabilmesi için değişmeyen parametrelere ihtiyaç vardır Bunlar: 1 genetik kalıbı kesin olarak bilinmelidir; 2 üç kuşaklı geniş aileler seçim nedenidir 3 örnek birleştirme yaklaşımı genetik kalıbına tarafından olur Mesela otozomal egemen bir gen ile kalıtılan bir hastalık haritalanmak isteniyorsa misal toparlama hasta bireyler, varsa eşleri ve tüm çocukları yanısıra, adi bireylerin yalnızca kendileri biçiminde olmalıdır Otozomal resesif bir rahatsızlık laf konusu olduğu süre ise, çoğunlukla taşıyıcı olan annebaba ve tüm çocuklarının toplanması yeterlidir Pedigri (aile ağacı) analizleri yapılmaksızın yalnızca sporadik vakalar üzerinden linkaj analizini uygulayabilmenin imkanı yoktur (6) Şekil 2’de otozomal etken bir genle kalıtılan bir rahatsızlık üzerinden linkaj analizi görülmektedir b) Nonparametrik metodlar: Niteliklerin kalıtım kalıplarını belirlemek defalarca kolay değildir Böylece fazla kalıtımsal özellik fazla faktörlü bir genetik kalıbı gösterir ve bunlar için hipoaaa oluşturmakta zorluklar yaşanır Tekrar defalarca birkaç kuşağı bir arada bulmak ve örneklemek olanaksızdır Özellikle geç yaşta başlayan hastalıklarda genellikle önceki kuşaklar ölmüştür, genç kuşaklarda ise az önce hastalık ortaya çıkmamıştır Bu durumda, eksiklikler göz önüne alınarak parametrelerden bağımsız olan nonparametrik metodlar diğer bir deyişle assosiyasyon çalışmaları önerilmektedir Assosiyasyon çalışmaları için bambaşka istatistik bilimi analizler önerilmişse de bunların anında hepsinde kuşaklar arası segregasyonun deneme edilmesinden çok, vaka ve kontroller arasında manalı ayrım olup olmadığı deneme edilmektedir Bu metodların linkaj analizine göre avantajları: 1 Genetik kalıbının bilinmesine lüzum yoktur 2 Ailelerden fazla vakaların ve kontrollerin toplanmasına lüzum vardır Dezavantajları ise 1 Misal sayısı fazla artı olmalıdır 2 Özellikle yoklama grubunun oluşturulmasında çok tedbirli olunmalıdır 3 Sadece bu metoda dayalı gen bulunması maliyeti fazla yüksek olan çalışmalardır ve genellikle başarısızlıkla sonlanmıştır Şekil 3’te assosiyasyon çalışmalarından anlamlı bir netice bulabilmek için ideal olarak seçilmesi gerekli örnek sayıları verilmiştir Görüldüğü gibi her iki metodun da birbirine tarafından avantajları ve dezavantajları vardır Eğer lokalizasyonu kimsesiz ispatlayacak büyüklükte aile paneli oluşturulabilmişse ve özellik tek gen genetik modellerinden birini gösteriyorsa seçilecek yöntem çekinmeden linkaj olmalıdır Karmaşık niteliklerde assosiyasyon metodlarından birisi seçilebilir Bu amaçla günümüzde yaygın olarak önerilen iki kademeli bir egzersiz planı izlenmektir (“two stage strategy (7) Burada genellikle büyük aileler üzerinden tüm genom taranır Potansiyel lokus’lar saptandıktan daha sonra yalnızca ilgili kromozom bölgelerine yönelik olarak assosiyasyon çalışmaları düzenlenir 3 Haritalamada kullanılacak marker’lar (kalıtımsal belirleyiciler) dürüst olarak seçilmeli, mevcut gen haritaları etkin olarak kullanılmalıdır Bu kısımda gen haritalamasında kullanılan “polimorfik marker terimini tamamiyle kavramak gereklidir Genetik yapıdaki değişiklikler en genel anlamı ile dönüşüm tanımı ile belirlenir Mutasyonlar toplumda görülme frekansları nadir olan (allel frekansı 00001) ve genetik hastalıklardan sorumluluk sahibi olan değişikliklerdir Polimorfizm kavramı da tekrar mutasyon gibi kalıtımsal materyaldeki bir değişikliği gösterir fakat birçok süre mutasyonda olduğu gibi fenotipik bir değişiklikle sonlanmaz Polimorfik değişikliklerde, nadir allel frekansı 001 dolayındadır yani toplumda yaygın olarak gördüğümüz değişikliklerdir (8) Örneğin genomda hastalıklardan sorumluluk sahibi olmayan fakat kişiden kişiye farklılık gösteren kısa DNA tekrarlarından oluşan bölgeler vardır Bunlar STRP (Short Tandem Repeat Polymorphism) olarak adlandırılırlar Burada ikili, üçlü veya dörtlü nükleotid tekrarları vardır Bunlar içerdikleri kopya sayılarına göre DNA örneklerinin öbür büyüklükte olmaları ile sonlanır ve elektroforezde yürütüldükleri süre bambaşka büyüklükte bantların görülmesine niçin olurlar (Şekil 1) Eğer bir kişiye ait DNA örneği, genomda bu özelliği belirten bölgelere özgü primerler kullanılarak “Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR, polymeraz chain reaction) yolu ile çoğaltılır ve elektroforezde yürütülecek olursa o kişiye ait polimorfik marker’lardan oluşan bir DNA profili ortaya çıkar Bu tıpkı parmak izi gibidir, bireyler aralarında farklılık gösterir Birkaç kuşaklı aile bireylerinde böyle bir amplifikasyon yapılırsa kromozomların kuşaklar aralarında dağılımı, bu polimorfik marker’lar aracılığı ile belirlenir Bu Vesile Ile baştan beri tartıştığımız kromozomlardaki mayozda oluşan parça değişimleri ve sonundaki muhtemel rekombinant ürünler aile bireylerini birkaç kuşak izleme yolu ile saptanabilir İnsan genom projesinde genlerin haritalanması için birincil aşamada planlanan, tüm genomda böyle polimorfik özellikler belirten markerların bulunması ve yalnızca bu bölgeleri çoğaltmaya yönelik primer dizinlerinin kromozom lokalizasyonları ve birbirlerine kadar sıraları saptanarak bu bilgilerin kullanıma açılması idi Bu amaçla üç kuşaklı geniş aileler bulunarak örneklendi (CEPH; Centre d’Etudes du Polymorphisme Humanie) (9) Bunlar genomda bulunan polimorfik markerlar için tiplendirildi Birbirlerine göre olası lokalizasyonları linkaj analizi yapılarak hesaplandı ve haritalar oluşturulmaya başlandı aynı zamanlı olarak sitogenetik haritalama da bir kısım markerlar için yapılarak sadece olanak olarak lokalizasyonları yok kromozom bantlarına kadar de lokalizasyonları bulundu Sitogenetik olarak lokalizasyonları bilinen markerlar referans noktaları olarak kullanılarak genomu 12 cM aralıklarla tarayacak haritalar oluşturuldu Genethon, Evry, Fransa laboratuvarlarında son derece başarılı olarak saptanan bu marker lokalizasyonları, araştırıcıların kullanımına açıldı (911) Bunu takiben diğer gen haritalama üniteleri de kendi bulgularını veri bankalarına koydular Tablo I’de böyle bir haritadaki birimlerin ne kavrayış geldiğini ve nasıl kullanılacağı gösterilmiştir Bu haritalara ait bilgilere, The Center for Medical genetics, Marshfield (Mammalian Genotyping Service sponsored by The National Heart, Lung and Blood Institute); Cooperative Human Linkage Center (CHLC) (http:lpgncinihgovCHLC); UTAH Genome Center (Utah Genome Depot); The Genome Database (The GDB Human Genome Database) internet adreslerinden ve Genethon haritası için 6 numaralı kaynakçadan ulaşmak mümkündür Bu haritalar kullanılırken dikkat edilecek iki nokta vardır 1 Haritalar markerların kromozomlar üzerindeki sırasını ve birbirlerine genetik olarak uzaklıklarını vermektedir Genotipleme yapılırken bu sıraların yanlış tutulması, yerlerinin karıştırılması veya rekombinasyon biriminden (cM), aralarındaki uzaklıklara dikkat edilmemesi gen haritalama çalışmalarının başarısızlıkla sonlanmasına niçin olur 2 Bambaşka merkezlerin marker haritaları birbirlerine tarafından ayarlanmamıştır Diğer bir deyişle bir haritadan elde edilen bilgiler ile yapılan bir haritalama çalışması diğer haritalarla uygunluk göstermeyebilir böylece çoğunlukla tüm harita bilgilerine etken olarak zorunlu çalışmayı yapmak en doğrusudur Bu noktada bütün bilgi bankalarındaki verileri karşılaştırmalı olarak bir oranda bünyesinde içeren The Center for Medical Genetics, Marshfield, USA (Mammalian Genotyping Service sponsored by The National Heart, Lung and Blood Institute) data bankasını referans olarak kullanmak yazarlardan birinin (ANA; nakarsu@hacettepeedutr) önerisi olacaktır Marker haritalarındaki bilgileri kullanarak yapılacak bir gen haritalaması için esas 2 yol seçilebilir: a Namzet lokalizasyon yaklaşımı: Burada haritalanacak olan niteliğe ait eldeki bütün veriler göz önüne alınarak namzet genler belirlenir Mesela başboyun bölgesine ait bir malformasyon haritalanacaksa baş ve boyunda açıklama bulan ve gelişimsel olarak bu bölgelerin oluşumuna katkıda bulunan genlerden açtırmak daha olasıdır Aday genler belirlendikten sonra bu genlerin hangi kromozom bölgelerinde bulunduğu saptanır ve bu bölgelere sıkı temas bildiren marker’lar öncelikli olarak test edilir Bu müşteri marker bilgilerine ulaşmak için OMIM (OnLine Mendelian Inheritance in Man) ve LOCUSLINK internet adresleri en kullanışlı adreslerdir Bu adreslere National Resource for Molecular Biology Information (NCBI) web sayfasından ulaşılabilir (NCBI HomePage) Bu bilgi bankaları birbirleri ile ilişkili olduğu için düşünülen aday gen saptandığı anda, öteki veri bankalarına ulaşılarak ilişkili marker bilgilerini olmak olanaklıdır Namzet bölgelerin taranması bitip de herhangi bir lokalizasyon saptanamazsa bütün genomun taranmasına geçilir b Genom taraması (random genomewide search): Burada hastalığın hangi kromozomda ya da hangi aday gen ile ilişkili olacağına dair bir önsezi yoktur Genomu 1020 cM aralıklarla tarayan, kromozom lokalizasyonları kesin marker panelleri kullanılarak tüm genom tesadüfen taranmaya başlanır İstatistiksel olarak anlamlı sonuç bulunacak kromozom parçasına rastlanılmaya çalışılır Ara Sıra bütün genom tarandıktan daha sonra bile lokus saptanmayabilir O süre genomu daha sık aralıklarla tarayan (5 cM) marker panellerine vermek gerekli olabilir Genomu 20cM aralıkla göz atmak için zorunlu olan marker sayısı yaklaşık 200; 810 cM aralıkla incelemek için zorunlu olan 400 ve 5cM aralıkla incelemek için gerekli olan rakam ise 750’den fazladır (1011) Bu sayıda marker ile çalışma maliyetinin, genotiplenecek misal sayısı arttıkça artacağı açıktır O nedenle genom taramaları için genellikle eldeki bütün örnekler kullanılmaz İstatistiksel olarak en çok data verecek bireylerden oluşan bir başlangıç paneli (initial screening panel) seçilir, genom bu bireyler üzerinden taranır ve potansiyel lokusların ispatı ve bölgenin daraltılması için eldeki bütün bireyler kullanılır (saturation mapping) Buraya dek anlatılanlardan anlaşılacağı gibi kalıtımsal haritalama için kullanılan laboratuvar deneyleri teknik olarak kompleks bir yapı içermez Kromozom lokalizasyonu tanıdık primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu, poliakrilamid jel elektroforezi, boyama ve genotipleme işlemleri yüzlerce defa tekrarlanır böylece floresan markerların kullanıldığı ve tek bir artma işleminde çok sayıda marker kullanılan, otomatik genotipleme yöntemleri geliştirilmiştir Oysa bu yöntemler zamandan tasarruf sağlarken maliyeti de çok yükseltmektedirler Kalıtımsal haritalama projelerinde kabul edilmesi gerekli bir diğer önemli nokta da öteki araştırma disiplinlerinden farklı olarak bu tip projelerin hazırlanmasında muhakkak sınırlarla belirlenen kuralların olmayışıdır Örnek sayısı, seçilecek metodoloji, marker sayısı ve maliyet, niteliklerin kalıtım kalıplarına, fenotipe, saptanabilen aile sayısına ve en önemlisi talih faktörüne alt olarak değişken Ayrıntılarıyla kısmet eseri olarak taramaya başlanılan ilk lokalizasyonda bağlantının saptanması ile genomu iki kere taradıktan sonradan lokalizasyonu bulabilmenin maliyetinin değişeceği açıktır Özet Olarak denilebilir fakat yapılacak teknik işlem her çalışmada benzer olmasına karşın yorum ve planlama her bir çalışmada ayrı özellikler ve tuzaklar içerir 4 Istatistik değerlendirmeler metoda tarafından seçilmelidir: Linkaj analizi için; LOD Skor (Logaritm of Odds Ratio) analizi uygulanır LOD Skor: Linkaj saptanması olasılığının linkaj gözlenmemesi olasılığına oranının logaritmik değerde açıklama biçimidir Diğer bir deyişle rağbette genin, deneme edilen kromozom lokusunda olması olasılığının ilgili lokusta bulunmaması olasılığına oranıdır Sonuçta meydana çıkan değer arttıkça lokalizasyonun saptanması olasılığı da artacaktır Mesela bu değerinde 5 gibi bir rakam çıkarsa aranılan genin test edilen kromozom lokusundan seçilen marker’a temas göstermesi olasılığı temas olmaması olasılığından 105 defa (100000 kez) daha fazla olacaktır Negatif değerler de lokustan uzaklaşıldığının göstergesidir LOD Skor 3 ve üstü olan değerler bağlantıyı desteklemesi açısından manalı kabul edilirken 2 ve gitgide artarak negatifleşen değerler ise kesinkes temas yokluğunu destekler Aradaki değerler yoruma açıktır Lokusun ispatlanabilmesi için bir dizi ayrı operasyon yapılması gerekebilir (aile ve örnek sayılarının arttırılması, genomun diğer bölgelerinin araştırılması vs gibi) Burada önemle belirtilmesi gereken nokta bu analizde sonuçta yer alan bir olasılık değeridir ve saptanan lokus gerçek lokus olmayabilir Nitelikten sorumlu ilgili gen ve gen içi mutasyon gösterilinceye dek lokus informasyonu yanıltıcı olabilir LOD Skor analizleri için yaygın olarak kullanılan program J Ott kadar geliştirilmiş olan LINKAGE paket programıdır (12) Bu program amaca kadar kullanılacak 4 daha aşağı programdan oluşur (MLINK, ILINK, LODSCORE ve LINKMAP programları) İki lokusun birbirine göre test edilmesi (mesela, hastalık lokusunun marker allel’e bağlantısı) için en çok MLINK kullanılırken, polimorfik nitelikteki markerların birbirlerine göre lokalizasyonlarının ve sıralarının saptanmasında ILINK programı kullanılmaktadır LODSCORE bütün olasılıkların hesaplanması yerine sadece maksimum olasılıkların hesaplanmasında, LINKMAP ise aniden fazla marker içinde haritalanmak istenen genin göreceli pozisyonunun bulunmasında (“multipoint linkaj analizi) kullanılan daha alçak programlardır Programın kullanımı sırasında özellikle parametrelerin belirlendiği dosyaların oluşturulması nitelik talep eder Bu amaçla farklı gen haritalama laboratuvarları LINKAGE programı ile ilişkili ek programlar kullanmaktadırlar Bu konuda kullanılan tüm programlara linkage software list (page 1) adresinden varmak mümkündür Assosiyasyon metodları için; Bu alanda en sık kullanılan metodlar şunlardır 1 Olgu ve denetleme çalışmaları, 2 Identity By Descent (IBD) (13) 3 Sib pair (14), 4 Affected Pedigree Member (APM) (15), 5 Transmission Disequilibrium Test (TDT) (16) ve 6 Haplotype Relative Tehlike (HRR) (17) Bedensel ya da moleküler haritalar, genomik DNAICODEnın klonlanmış parçalarının düzenlenmesiyle oluşturulurlar ve baz çifti sayılarına kadar ayarlanmışlardır Kalıtımsal haritadan farkı burada doğrudan doğruya DNA’yı oluşturan bazların sırası belirlenmiştir Böylelikle genlerin maddi yapıları kesinkes ortaya konabilmektedir Haritalama projelerinin en son aşamadaki amacı olan maddi harita en yüksek rezolüsyona sahiptir Öteki yandan, ökaryotik genomun fazla küçük bir yüzdesi açıklama olunduğu için, bir takım fiziki haritalama yöntemleri, sadece trankripsiyonun gerçekleştiği dizilerin tanımlanmasına yönelmiştir Genetik haritada olduğu gibi insan genomunun maddesel haritası da 24 bambaşka kromozom için oluşturulur Farklı kromozomlar için benzer polimorfik marker gruplarını belirten kalıtımsal haritaların aksine, farklı tiplerde maddi haritalar meydana getirmek mümkündür Maddesel haritalamanın en son hedefi DNA baz dizisinin çıkarılmasıdır Ancak geniş DNA bölgelerinin dizi analizinin yapılması teknik açıdan zorlama olduğu için haritalamada çözünürlüğü 1 MbICODEdan daha aza indiren iki esas usul geliştirilmiştir Bu yöntemler kullanılarak “Restriksiyon Haritalama ve doğal olarak uzatılmış ya da yapay olarak uzatılmış kromatin veya DNA fiberlerinde yüksek çözünürlüklü FISH’dir Rekombinant gen teknolojisindeki son gelişmelerle birlikte genomik DNA parçalarının klonlanması ve karakterizasyonuyla detaylı bir gen haritası edinmek mümkün hale gelmiştir Sonuçta da sadece gen yapısı hakkında bir kaynak olmakla kalmayan aynı zamanda genomda dizi organizasyonu, gen ve genomların evrimi hakkında da son derece kıymetli bir kaynak olan bütün bir genomun DNA dizisinin elde edilmesi mümkündür Günümüzde, pekçok model organizmanın örneğin; bakteri, Scerevisiae, Celegans, Dmelanogaster, Frubripes, Drerio, insan gibi organizmaların kalıtımsal ve maddesel haritalarını çıkararak sonuçta, bütün genom dizilerinin saptanmasını amaçlayan fazla yoğun bir şekilde devam eden bir uluslararası işbirliği sürmektedir ve bu model organizmaların bazılarının tüm genom dizi analizi tamamlanmıştır (Tablo II) (18) Genomların haritalanması, analizi ve dizi analizi ile ilgili disipline “genomiks„ adı verilmiştir Bütün dünyada binlerce bilim adamının yaklaşık 15 sene süren çabaları sonucunda insan DNAICODEsının az kalsın bitmiş nukleotid dizisi yani haritası ortaya çıkmıştır Gen haritaları bir uçtan bir uca bitki ve hayvan üreticileri kalıtımsal olarak iyileştirilmiş kalitede imal yapabilirken, insan genom haritasının çıkarılması açısından bakıldığında, biyokimyasal temeli bilinmeyen kalıtımsal hastalıklara niçin olan genlerin özgül bir kromozom ya da kromozom bantı üstüne haritalanması, soyağaçları üzerinde bir marker ile olan bağlantısına dayanarak bu genin izinin sürülmesi (yine tracking), hastalığın çare edilmesi, insan ırklarının evrimleri ve ırkların dünya üzerinde göç yollarının çıkarılması muhtemel olacaktır